摘要：目的考察不同时期刺五加叶中8种有效成分含量和干质量的动态变化规律，探讨刺五加叶的适宜采收期。方法采集不同时期刺五加叶片，用电子天平测定百叶干质量；采用HPLC对不同时期刺五加叶中L-苯丙氨酸、原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷和槲皮素进行测定，计算8种有效成分积累总量，并与主成分分析法相结合进行综合评价。结果不同时期刺五加的百叶干质量在S1～S5期间整体呈上升趋势，在S1～S2增长最为迅速；不同时期刺五加叶中8种有效成分的含量呈动态变化，原儿茶酸在S1（6月3日）期含量达到 值；其他7种成分均在S2（7月3日）期含量达到 值，且主成分分析结果也显示于S2期采收的刺五加叶中8种有效成分含量的综合得分 ；8种有效成分在不同时期的积累总量呈先上升后下降的变化规律，在S1～S2期间总量总体呈上升趋势，S2时达到 。结论综合不同时期刺五加叶的干质量和8种有效成分含量的变化可知，S2期前后（6月下旬至7月上旬）为最适宜采收期。为确定刺五加叶的适宜采收期提供基础资料。

刺五加叶是五加科植物刺五加Acanthopanaxseuticosus(Rupr.etMaxim.)Harms的干燥叶片[1]，临床研究表明刺五加叶中含有大量对人体有益的生物活性成分，具有调节机体免疫力、预防心脑血管疾病及改善睡眠等功效[2]。随着近年来对刺五加叶的开发利用不断增加，刺五加叶颗粒、袋泡茶及刺五加叶脑欣通等一系列产品相继推出[3-4]。但现阶段对刺五加叶的研究多集中于化学成分[5-8]、药理作用[9-11]以及现代应用[12-14]等方面，对刺五加叶采收期的研究鲜有报道，而适宜的采收期是保证刺五加叶质量的重要环节。因此，采收期的研究对刺五加叶的开发利用具有重要意义。

目前，对刺五加叶适宜采收期研究的考察指标较单一，难以客观、全面地反映不同时期刺五加叶的内在品质，如陆珞等[15-17]以紫丁香苷、*酮类和多糖为考察指标对刺五加叶的采收期进行了研究。近年来研究发现刺五加叶苯丙素类成分含量较高，并且具有抗炎、抗氧化等作用[18]；原儿茶酸是多种中药的活性成分，如益智仁、丹参、芙蓉等，而刺五加叶中原儿茶酸的研究较少，关于原儿茶酸的药理作用已有大量报道，其具有良好的抗氧化和神经保护的作用[19-20]。因此，本实验选取苯丙素类的L-苯丙氨酸、紫丁香苷、绿原酸、咖啡酸，*酮类的芦丁、金丝桃苷、槲皮素及原儿茶酸作为考察指标。此外，产量也是判断刺五加叶适宜采收期的重要指标，本实验测定了刺五加的百叶干质量，并与多指标成分含量测定相结合进行了综合评价，确定刺五加叶的 采收期，为刺五加叶的科学采收和合理利用提供依据。

1材料

Waters型高效液相色谱仪（美国Waters有限公司PDA检测器）；KM-C超声波清洗器（广州市科洁盟实验仪器有限公司）；MettlerToledo电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；H台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；BGZ-30电热鼓风干燥箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）。

对照品L-苯丙氨酸（批号J04J7R）、原儿茶酸（批号Z30M6L1）、紫丁香苷（批号P14J7F）、绿原酸（批号Y24J7K）、咖啡酸（批号Y17D6C）、芦丁（批号Y06J8S）、金丝桃苷（批号Y04A9X）、槲皮素（批号C20J6Y），质量分数均≥98%，均购自上海源叶生物科技有限公司；HPLC流动相乙腈为色谱纯（JKScientificLtd.公司）；水为娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；其余试剂均为分析纯。

刺五加叶样品采自黑龙江省哈尔市黑龙江中医药大学药用植物园，分别于年6月3日（S1）、年7月3日（S2）、年8月3日（S3）、年9月3日（S4）、年10月3日（S5）进行取样，为保证样本的代表性，对10棵同一年限的固定刺五加植株进行随机等量取样、均匀混合。所有样品均由黑龙江中医药大学中药资源学王振月教授鉴定为五加科植物刺五加Acanthopanaxseuticosus(Rupr.etMaxim.)Harms的叶。6月份生长旺盛阶段，叶片数不断增加，7月份进入生殖生长阶段，叶片数不断增加。8月末9月初叶片数量不断减少，10月份叶片泛*脱落。

2方法

2.1刺五加叶干质量测定

将不同时期的刺五加叶样品分别烘干至恒定质量，每个时期分别随机选取刺五加叶片，重复3次，用电子天平测定质量。

2.2色谱条件

采用WelchromC18色谱柱（mm×4.6mm，5μm），以乙腈（A）-0.3% 水溶液（B）；流动相梯度洗脱，洗脱程序：0～40min，10%～36.7%A，进样体积20μL；体积流量1mL/min；检测波长nm；柱温30℃；在上述条件下，8种成分与其他相邻峰的分离度均大于1.5，理论塔板数以各成分色谱峰计均高于。色谱图见图1。

2.3溶液制备

2.3.1对照品溶液制备精密称取L-苯丙氨酸、原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮素对照品适量，加 溶解，配成质量浓度分别为0.、0.、1.、1.、0.、5.、5.、0.mg/mL的对照品溶液，备用。

2.3.2供试品溶液制备精密称取干燥至恒定质量的样品粉末（过60目筛）1.0g，置于10mL量瓶中，加入10mL ，称定质量，室温下，超声功率W，超声提取60min（每30分钟停止15min）后取出，放冷用 补足减失质量，摇匀，置于10mL离心管中r/min离心10min，吸取上层清液过0.22μm微孔滤膜，即得。

2.4线性关系考察

以配制好的对照品溶液为母液，对其进行倍比稀释，稀释成一系列质量浓度的溶液，按照“2.2”项下色谱条件进样测定，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，结果见表1。各成分在各自线性范围内线性关系良好。

2.5方法学考察

2.5.1精密度试验取对照品溶液适量，在“2.2”项色谱条件下，连续进样6次，测得L-苯丙氨酸、原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮素峰面积RSD分别为1.69%、1.78%、0.58%、0.79%、1.22%、0.98%、1.04%、0.86%。

2.5.2重复性试验取S1样品6份，每份各1g，分别制备成供试品溶液，按照“2.2”项下色谱条件进行含量测定，测得样品中各成分RSD分别为1.01%、0.67%、0.85%、1.12%、1.26%、1.05%、1.37%、1.56%，表明该方法重复性好。

2.5.3稳定性试验取同一供试品溶液，室温下0、6、8、10、12h分别进样，按照“2.2”项下色谱条件进样各成分的峰面积RSD分别为0.65%、0.88%、1.02%、0.89%、1.62%、1.44%、2.01%、0.83%，表明供试品溶液在12h内稳定。

2.5.4加样回收率试验精密吸取已知含量的提取液2mL，加入适量对照品溶液，加入 定容到5mL，平行制样6份，按“2.2”项下色谱条件进行分析，每份溶液进样平行测定3次，计算回收率。8种成分的平均加样回收率在99.89%～.24%，其RSD在1.25%～2.35%，表明此方法准确性良好，符合试验要求。

2.6样品含量测定

5批样品，每批3份，按照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下测定，根据相应已知的标准方程计算其样品含量。

2.7数据处理

数据统计和主成分分析等采用Excel及SPSS21.0软件完成。

3结果与分析

3.1不同时期刺五加百叶干质量动态变化

经测定，不同时期刺五加百叶干质量动态变化情况如图2所示。

由图2可知，刺五加百叶干质量在S1～S5生长季节里呈不断增长趋势，在S1～S2期迅速增长，S2～S3期增长减缓，S3期之后缓慢增长，S5期刺五加百叶干质量达到 值。

3.2刺五加叶8种成分含量动态变化

按照“2.6”项下的方法测定不同时期刺五加叶中8种成分的含量，变化趋势见图3、4。

于同一地点不同时期采收刺五加叶，8种成分含量积累变化有差异，其中L-苯丙氨酸和槲皮素含量波动变化较小，原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷含量变化波动较大。结合图2、3进行详细分析，在S1时，除原儿茶酸达到监测全程的含量积累 值0.mg/g外，其他5种成分含量均处于较低水平，但在S1～S2期间，这5种成分都处于积累升高状态。在S2时，除原儿茶酸含量积累有所下降外，紫丁香苷、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷这5种成分含量均达到监测全程的 值，分别0.、6.、1.、42.、46.mg/g。在S3至S5期间，8种有效成分含量均呈下降趋势，以咖啡酸、芦丁、金丝桃苷下降较为明显。在S5时，除L-苯丙氨酸和紫丁香苷外，其他6种有效成分含量均达到监测全程的最小值，分别为0.、0.、0.、0.、0.、0.mg/g。

3.3不同时期每百片刺五加叶中8种有效成分积累总量变化趋势

从图5可知，不同时期刺五加叶8种成分积累总量（有效成分积累总量＝有效成分总量×百叶质量）整体呈先上升后下降的变化规律。即在S1～S2期间总量总体呈上升趋势，到S2时达到 ，为1.g，S2～S3期间总量急剧下降，S3～S5之后随着采收时间的推迟，有效成分积累总量（每百叶）呈明显下降趋势。

3.4基于主成分分析的不同时期刺五加叶的综合评价

主成分分析，是考察多个变量间相关性的一种多元统计方法，通过原始变量中导出少数几个主成分，使它们尽可能多的保留原始变量的信息，且彼此间互不相关，将多个具有相关性指标转换成少数几个互相独立的综合指标（即主成分），通过将各指标得分与其权重结合进行综合评分[21-22]。

参考何首乌[23]、草珊瑚[24]、头花蓼[25]等中药材的采收期综合评价方法，采用SPSS21.0统计软件，对L-苯丙氨酸、原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮素进行主成分分析，计算其相关矩阵特征值与特征向量，得到特征值和贡献率见表2。

由表2可知，特征值大于1的有2个主成分，两者方差累积率为92.24%＞80%，能够客观反映刺五加叶药材的内在质量，故选取F1、F2进行分析。根据特征向量，计算刺五加样品各自主成分得分，由此可以得到主成分线性组合表达式，F＝0.F1＋0.F2，其中F为综合得分，F1为第1主成分，F2为第2主成分。由主成分综合评价表达式，可以计算出不同时期刺五加叶综合评价得分并排序，结果见表3，综合得分值值越高，综合品质越好。再将8种成分积累总量与主成分综合评价得分结合做图，结果见图6，由此来确定最适宜采收期。

根据表3综合评价排序可以看出，刺五加叶在S2（7月3日）时采收样品F值 ，并与直观折线图分析结果一致。并由图6可知，在考虑L-苯丙氨酸、原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮素这8种成分积累总量时，S1～S2期间（6月下旬～7月份上旬）为刺五加叶最适宜采收期。

4讨论

预试验对提取溶剂（体积分数为50%、75%、% ）、提取时间（30、40、60min）进行了考察，结果表明，% 为最适宜提取刺五加叶的溶剂，60min为 提取时间，但为了防止超声时间过长产热，对提取效果有影响，每提取30min时，会停止15min。因此选择% 提取60min（每30分钟停止15min）。

此实验首次采用HPLC对刺五加叶中L-苯丙氨酸、原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷和槲皮素的含量进行了测定，建立方法初期，首先采用 -水与乙腈-水，分别作为流动相，结果表明分离效果均不好，并且难以达到基线分离，后以乙腈-0.1% 水溶液为流动相，分离效果明显得到改善，但个别峰依旧出现严重拖尾现象，故增加 水溶液为0.3%，结果分离效果较为理想。

等度洗脱时，其他成分相互有干扰，而采用梯度洗脱时，各有效色谱峰和分离效果良好。同时，检测时为保证8种指标成分都具有较高的灵敏度，能够准确测定各成分含量，采用全波长扫描，发现在mm处，均具有较大的吸收值。

以往研究对刺五加叶采收期的研究都以单一化学成分或单一类成分作为考察指标，难以客观、科学地反映其内在质量，而本次研究首次以刺五加叶中8种有效成分作为考察指标，采用主成分分析法对不同采收期刺五加叶中8种有效成分含量进行了综合评价，并将8种有效成分积累量与叶片干质量结合分析，结果更加科学合理，为刺五加叶适宜采收期提供数据支持，同时也为刺五加叶内在质量综合评价体系的建立提供参考。

对比张爽等[26]对不同时期刺五加茎中有效成分积累量的动态变化研究发现，在6月初，茎、叶共有的有效成分均处较低的水平。在7月初，刺五加茎、叶中有效成分积累量均呈上升趋势，且刺五加叶中的有效成分的积累量达到了 水平。在8月之后刺五加茎中的有效成分积累量呈稳定升高的趋势，而刺五加叶中有效成分积累量均呈明显下降趋势，其可能与刺五加的养分传输具有节律性有关，所以确定刺五加叶的适宜采收期对于整个植株的研究具有重要的意义。特别是对于刺五加这种濒危物种，自然资源极为有限，制约该种群可持续自然更新的因素又很多，如何保持 生物利用度的利用刺五加资源具有深远的研究价值。

参考文献（略）

来源：李俊萍，付士朋，王谦博，王聪，赵天琪，王振月.多指标综合评价刺五加叶适宜采收期的研究[J].中草药,,50(13):-.

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长按







































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