SalvianolateamelioratesoxidativestressandpodocyteinjurythroughmodulationofNOX4activityindb/dbmice

丹参多酚酸盐通过调节db/db小鼠的NOX4活性来改善氧化应激和足细胞损伤

JCellMolMed.Jan;25(2):-.IF:5.31(Q1).

研究背景：糖尿病肾病（Diabeticnephropathy,DN）是终末期肾病的主要原因，足细胞损伤被认为是肾小球滤过屏障功能障碍的一个关键因素，持续的足细胞损伤可导致蛋白尿、肾小球硬化和肾功能的损害，可以通过靶向足细胞来探索防治肾损伤的新治疗靶点。有大量证据表明，足细胞的氧化损伤可能在DN的发病机制中起着关键作用，NADPHoxidases(NOXs)似乎是糖尿病中介导肾小球损伤的最重要因素。有文献表明，NOXs与ROS和蛋白尿的增加相关。特别是，来自足细胞的线粒体Nox4可能是DN中线粒体功能障碍和足细胞凋亡的关键诱导物。丹参多酚酸盐（Salvianolate,Sal）的主要生物活性成分SalB被证明可以改善db/db小鼠的高血糖和血脂异常。团队之前已经证明SalB具有抗氧化作用保护肾小管细胞免受碘造影剂诱导的急性肾损伤（acutekidneyinjury,AKI）。

结果分析

EffectsofSALonthebiochemicalparametersofdiabeticmice

SAL对糖尿病小鼠生化指标的影响

为确定SAL对DN的影响，给db/db糖尿病小鼠或非糖尿病db/m小鼠给予SAL(80mg/kg)或生理盐水，持续16周。如表所示，经生理盐水或SAL注射处理后的db/m和db/db小鼠的体重、肾脏体重、空腹血糖水平和白蛋白水平。生理盐水处理的db/db小鼠呈现出高血糖，高体重，高肾重，高白蛋白水平，而注射SAL可改善这样的趋势。

SALameliorateddiabetes-inducedglomerularinjuryindb/dbmice

SAL可改善db/db小鼠的糖尿病诱导的肾小球损伤

DN的病理特征之一是严重的系膜增生和足细胞丢失。PeriodicAcid-Schiff染色显示，与对照组db/m小鼠相比，SAL减轻了肾小球系膜基质沉积（图A）。肾脏切片透射电镜显示，与生理盐水处理的db/db小鼠相比，SAL处理显著减轻了db/db小鼠肾小球足突严重和弥漫性消失（图B）。

SALpreventedpodocytelossindb/dbmice

SAL防止了db/db小鼠的足细胞丢失

为了确定SAL对足细胞丢失的作用，对糖尿病肾切片中的足细胞标记物WT-1进行了免疫染色。SAL处理增加了db/db小鼠每个肾小球中WT-1阳性细胞的数量（图C）

通过共同标记WT-1和TUNEL来评估db/db小鼠中足细胞的凋亡。TUNEL分析显示，生理盐水处理的db/db小鼠肾小球中足细胞凋亡明显增加，而SAL处理可逆转这一现象（图A）。这些结果表明，SAL治疗可减轻了db/db小鼠的足细胞损伤。

SALattenuatedrenaloxidativestressindb/dbmice

SAL可减轻db/db小鼠的肾氧化应激

考虑到糖尿病患者的肾损伤与ROS形成增加有关，测量糖尿病小鼠肾皮质中8- -2脱氧鸟苷(8-OHdG)水平，这是氧化DNA损伤的标志。与生理盐水处理的db/db小鼠相比，SAL处理的db/db小鼠8-OHdG表达强度明显降低（图B）。此外，SAL处理补偿了db/db小鼠的抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)水平的下降（图C）。与db/db对照小鼠相比，SAL处理的db/db小鼠的氧化应激相关酶和肾丙二醛(MDA)水平也降低了，表明了肾组织中脂质 化水平的降低（图D）。简单地说，SAL治疗减轻了db/db小鼠的高血糖诱导的肾氧化应激。

SALsuppressedNOX4-basedNADPHoxidaseactivityindb/dbmice

SAL抑制了db/db小鼠中基于NOX4的NADPH氧化酶活性

SAL对NOX4的影响体现在转录、翻译和酶活性三个水平上。考虑到NOX4是DN肾脏中氧化应激的主要来源，探讨SAL对NOX4表达和活性的影响。经SAL治疗后，db/db对照组小鼠肾小球中NOX4表达的增加明显减弱（图A）。这些效应与NOX4的mRNA水平的变化是平行的，利用荧光素的化学发光法测量了肾小球中NADPH氧化酶产生的超氧化物。在db/db小鼠中发现了肾小球中NAPDH氧化酶的激活，而SAL降低了db/db小鼠的NADP+/NADPH比值（图B）。这些发现表明SAL在基因和蛋白水平上抑制NOX4的表达，并最终从各个方面抑制酶活性。

SalBblockedHG-inducedNOX4-basedROSgenerationandapoptosisinhumanpodocytes

SalB阻断了高糖诱导的人足细胞中基于NOX4的ROS生成和凋亡

通过AnnexinV-FITC和DCFH-DA荧光检测，人足细胞暴露于高糖环境24h后，细胞凋亡率和细胞内 水平显著升高。在用SalB或GKT（NOX1/NOX4抑制剂）处理的足细胞中，高糖诱导的ROS产生增加和凋亡率降低（图A、B）。此外，SalB处理也显著降低了高糖诱导的Nox4蛋白水平的升高（图C）。这些结果与db/db糖尿病小鼠体内的相关性一致。

AMPKisrequiredforSalBtoattenuateNOX4-inducedpodocyteapoptosis

SalB需要AMPK来减弱NOX4诱导的足细胞凋亡先前的研究提出AMPK是NOX4的上游调控因子，为了确定SalB是否通过AMPK调控发挥抗氧化作用，通过siRNA敲除AMPK的表达。转染siRNA24小时后AMPK蛋白水平显著降低。首先，在高糖培养的细胞中，用SalB处理恢复了AMPK的 化以及AMPK的活性。SalB还阻止了高糖环境下中NOX4蛋白表达的增加（图A）。其次，用siRNA-AMPKα抑制AMPK可显著增强高糖诱导的足细胞中Nox4蛋白的基础表达，而siRNA-AMPKα也消除了SalB对NOX4抑制的影响（图B）。为了证实基于线粒体的NOX4的ROS与高糖诱导的足细胞损伤有关，用单克隆抗体进行免疫染色证实NOX4主要定位于足细胞线粒体上。此外，通过流式细胞术和MitoSOX?染色证明转染siRNA阻断了SalB对高糖诱导的ROS和线粒体来源的ROS生成的保护作用（图C、D）。这些数据证实SalB的肾保护能力部分是通过AMPK介导的对NOX4表达的控制。

SalBinhibitedHG-inducedpodocyteapoptosisviablockadeofmitochondrialNOX4

SalB通过阻断线粒体NOX4来抑制高糖诱导的足细胞凋亡

为了进一步阐明SalB对NOX4调控的确切机制，siRNA感染人足细胞。siRNA在人足细胞中有效下调Nox4蛋白（图A）。siRNA和SalB治疗对NOX4功能的损害导致了高糖诱导的人足细胞ROS生成和TUNEL水平减少，通过MitoSOXTM染色检测到，SalB处理导致高糖介导的线粒体衍生ROS产生增加显著减少，与siRNA-NOX4的作用相似（图B、C）。NOX4的沉默并没有消除导致的足细胞氧化应激和凋亡的增加，提示SalB可能通过抑制高糖对线粒体NOX4的上调来改善葡萄糖诱导的足细胞损伤部分。

结论

丹参多酚酸盐治疗减轻了糖尿病诱导的肾小球损伤，包括db/db小鼠肾脏中蛋白尿分泌、系膜基质扩张、足突消失和ECM积累。

丹参多酚酸盐通过调节NOX4活性改善足细胞氧化损伤。

SalB可以挽救足细胞免于氧化损伤，并防止DN的后续进展。